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早在上世纪60年代,除了传统的ACGU四种碱基外,Cohn等人已经在RNA上发现了大量的碱基位点修饰。Holley等人于1965年,首ci在酵母的tRNA中鉴定了包括假尿苷(pseudouridine)在内的十余种不同的RNA修饰。已知绝大部分真核生物中,mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰,作用包括维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运翻译起始以及与polyA结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定。云序生物聚焦于科研前沿领域,针对各类RNA分子、表观遗传学、蛋白质组学等研究热点为广大科研人员提供系统性解决方案。云序生物m6A RNA-seq实验采用预验证的商业化抗体。福州m6A环状RNA测序

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m6A研究思路 思路1 老数据挖掘 第一步:先从原有的转录组数据中,挖掘到差异表达的甲基化酶; 第二步:对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证,并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变; 第三步:在细胞(动物模型可选)中对这些酶进行敲低和过表达,进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况,并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平; 第四步:继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片,分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化; 第五步:找到甲基化酶调控的靶基因,进行敲低和过表达,看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救; 第六步:在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后,对靶基因上的motif进行点突变后进行验证; 第七步:鉴定新型的甲基化酶(可选)。福州m6A寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

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机体的整个生物学环境会影响m6A通路,并且决定了m6A的功能。一方面,不同的细胞,以及环境刺激能影响m6A这些效应器自身的表达水平,PTM以及细胞定位。例如,在多数细胞系中,m6A的去甲基化酶(demethylase)FTO主要位于细胞核,并且参与5%-10%的的mRNA的m6A去甲基化,但是在某些淋巴瘤细胞系中,这个比例达到40%。另一方面,RNA分子自身的异质性又增加了m6A的研究难度,这是因为:①RNA种类繁多,包括mRNA,tRNA,rRNA,以及其它大量的非编码RNA;②不同类型的细胞中的RNA丰度不同;③RNA存在着复杂的二级结构;④RNA存在着不同的转录状态(例如非活跃时,RNA与组蛋白紧密结合,转录活跃时,则与组蛋白松开);⑤RNA中的顺式/反式作用元件(例如一些RNA结合蛋白,RBP, RNA binding proteins)会调控m6A效应子与RNA底物。因此说,m6A的活动与环境紧密相关。

肺腺ai细胞中的 FTO 的表达是因为什么原因而下调的呢?为了回答这个问题,作者用 PROMO 软件分析 FTO 基因的启动子序列,在其中找到了 3 个有可能是 TBE 元件(LEF/TCF-binding element)的区域。为了验证生信预测的真实性,作者又进行了了一系列分子生物学实验。首先,ChIP 实验证实了 TCF4 与 FTO 启动子的结合。另外,荧光素酶报告基因的结果显示,β-catenin 也可通过结合前述的 3 个 TBE 元件来抑制 FTO 启动子。因此,β-catenin/LEF/TCF 复合体被证明可以抑制 FTO 启动子的活性。人类肺腺ai细胞系经过 Wnt 处理后,FTO 的 mRNA 和蛋白表达水平均有所降低,并且这种现象可通过敲降 β-catenin 来逆转。综合前面的几个发现可以证明:Wnt 在信号通路的上游,通过诱导 β-catenin,使得β-catenin/LEF/TCF 复合体结合到 FTO 启动子上,终抑制了 FTO 的表达。m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键。

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举例来说,潜在的m6A结合蛋白ELAV1 / HuR能够结合ARE区并稳定相应的转录物。对照和METTL3敲低细胞中差异mRNA表达水平的分析表明m6A稳定mRNA。甲基化的失去降低含有m6A4的转录本的表达水平。这种效应对于在内含子中含有m6A的mRNA是较突出的。这些数据的一个可能的解释是m6A是正确剪接mRNA所需要的,当被破坏时导致剪接受损和随后的mRNA降解。m6A对mRNA稳定性的影响可能是基因特异性的,因此全局RNA稳定性的显着变化不太可能发生。云序生物聚焦于科研前沿领域,针对各类RNA分子、表观遗传学、蛋白质组学等研究热点为广大科研人员提供系统性解决方案。云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服务。广东m6A是什么

赫捷院士团队揭密肺腺ai m6A 机制。福州m6A环状RNA测序

那么,c-Myc 蛋白的表达水平又是如何受到调控的呢?作者设计了荧光素酶报告基因,将荧光素酶报告基因插入 MYC 的 mRNA 中,并将实验组的 mRNA 3’ 端的 m6A 突变为其它碱基,对照组的 MYC mRNA 则不做任何碱基修饰。结果发现,FTO 敲降后,对照组的 MYC mRNA 表达了大量荧光素酶,但经过碱基突变而不再具有 m6A 的实验组则没有荧光素酶信号,说明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 对于蛋白的成功翻译不可或缺。相反地,如果过表达 FTO,那么肺腺ai细胞系的 c-Myc 蛋白的表达量会下降。但是,无论是 FTO 敲降还是过表达,MYC 的 mRNA 水平都没有改变。综上可知,c-Myc 蛋白表达量的变化,与 MYC mRNA 的 m6A 修饰水平正相关,而与 MYC mRNA 的表达水平无关。福州m6A环状RNA测序

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