miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA加尾法逆转录：增加miRNA逆转录产物长度较直接的方法就是增加miRNA的长度，即在miRNA的3端后面添加一段序列，然后进行逆转录反应。因此，加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。miRNA的加尾法逆转录和qPCR中的qPCR：miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆转录产物的5端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根据miRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。对于内参，生工生物的miRNA加尾法首先链cDNA合成试剂盒(B532451)中内置了内参U6的正向引物，使用该引物与通用引物R即可进行内参U6的扩增。逆转录实验中可以通过qPCR检测逆转录反应效果。深圳加尾法逆转录酶测序
miRNA加尾法逆转录：miRNA加尾法利用基因组中压缩miRNA元件，通过识别不同转录起始位置，将miRNA连接到其前体mRNA上这种方法可以注意到与miRNA相关的各种信息，例如miRNA功能特异性，miRNA的转录条件和miRNA的表达量等。miRNA的逆转录允许科学家们用特定的miRNA测序技术来节省时间。miRNA逆转录，可以检测miRNA的表达以及miRNA与RNA的瓦作关系，还可以检测miRNA的调节的位点。同样，miRNA表达量的研究也能够通过miRNA逆转录来进行，从而帮助我们更好地了解miRNA在细胞信号转导中发挥着重要作用。深圳加尾法逆转录酶测序逆转录实验尽量避免多次冻融处理RNA样品，避免样品质量下降。
逆转录酶的合成步骤：1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，依次加入2～5μgRNAnμL；3、65℃保温5min，然后冰浴5min；4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份：RNase抑制剂（40u/μL）0.5μL、10×M-MLVReactionBuffer2μL、DTT（200mM）1μL、逆转录酶（M-MLV）1μL；5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min；7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。逆转录酶的质量控制：物理纯度：在SDS－PAGE上>90%纯。储存缓冲液：20mMTris-HClpH7.5；200mMNaCl；0.1mMEDTA；1mMDTT；0.01%NP-40(一种去垢剂)和50%甘油。反应缓冲液：250mMTris-HClpH8.3；375mMKCl；15mMMgCl2；50mMDTT(以Part#M531A供应)。
miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA与mRNA的在qRT-PCR过程有所不同。一般来讲，mRNA比较长，其长度通常在几百至几千个核苷酸，因此使用随机引物(RandomPrimerp(dN)6)即可随机结合到mRNA的各位置进行逆转录。由于qPCR的过程只需扩增目的片段的一部分(80~200bp)，因此使用随机引物的逆转录产物尽管不完整，也完全能够满足qPCR的需求。当然，也可以使用OligodT引物统一从mRNA的ployA尾巴开始逆转录。这种逆转录引物在扩增cDNA全长时是必须的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用OligodT引物进行逆转录。逆转录的反应机理是RNA模板上的DNA合成。
逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择，逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。多逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。逆转录实验前应反复检查所有试剂盒的有效期和使用条件。深圳加尾法逆转录酶测序
逆转录实验反应过程中需控制反应温度，时间和pH值等指标。深圳加尾法逆转录酶测序
反转录酶的注意事项，随机引物：适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，首先链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（<500bp）的增加和长片断、全长产物产物的降低。酵母菌逆转录酶是逆转录酶家族中的一个重要表示，逆转录在研究RNA表达调控等领域有普遍的应用前景。深圳加尾法逆转录酶测序
