PG13宿主细胞蛋白（HCP）残留检测抗体覆盖率验证

宿主细胞蛋白通常是与重要细胞功能相关的蛋白，如细胞增殖、基因转录、蛋白合成修饰、细胞存活、细胞凋亡等，在工艺过程中分泌或因细胞死亡或裂解而释放。生产过程中，以下几个因素会主要影响HCP的组成和丰度：①宿主细胞基因组调控及培养工艺：特定工艺下，潜在的HCP数量可能非常大，且非所有基因都表达，某些基因在不同的时间和条件下表达；如大肠杆菌约4300个基因，不同的工艺产物会经历独特的翻译后修饰，增加了HCP的总数和生化复杂性。有研究表明，如大肠杆菌表达的蛋白，其不同蛋白之间存在数量差异，这些差异可能是对环境条件的适应性反应，但大多数 (85-90%) 有潜在免疫原性的宿主细胞蛋白在不同的发酵过程中都会出现。②产物表达方式：宿主细胞与外源基因、载体和辅助成分组成的体系可以稳定、瞬时和诱导表达；如大肠杆菌常见的表达形式有胞内表达、分泌表达、可溶性表达、不溶性的包涵体形式，以及融合和非融合表达。③纯化步骤及产品本身的特性的影响：纯化过程中大部分的HCP被去除(>99％)，残留的HCP仍保留在产品中，可能与产品共结合，一起被纯化。

毕赤酵母（Pichia pastoris）是第二代酵母表达系统中的代表性菌株，是美国FDA认定的GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物，具有表达水平高，产物活性好，培养成本低，易扩大为工业化生产等特点。在生物制药领域，酶制剂、胰岛素、表皮生长因子、胶原蛋白等多种生物制剂已经通过毕赤酵母系统进行商业化生产。与其他产品杂质一样，毕赤酵母宿主残留蛋白（HCP）可能对生物制品的安全性和有效性产生不利影响，因此在生产监测、产品放行等过程中需要对其进行定量研究并进行严格控制。SHENTEK^®毕赤酵母HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）是湖州申科生物自主研发、具有完全自主知识产权的、实现关键试剂全国产化的毕赤酵母HCP通用检测试剂盒。本试剂盒适用于基于GS115、X33等在内的毕赤酵母菌株生产的生物制品中宿主残留蛋白的定量检测，操作步骤少、快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

湖州申科生物参考USP通则<1132.1>阐述的内容，依托公司深耕生物制品质量控制领域十余年经验，针对LC-MS检测HCPs方法进行了评价与优化。同时通过对LC-MS检测HCPs整体流程建立完整的质控，建立起一套抗干扰能力强、稳定性好、准确度高、结果真实可靠的LC-MS检测HCPs标准方法。检测技术平台分成样品制备、质谱检测、数据生信分析及质谱结果方法验证四部分，已使用LC-MS平台进行了293T、不同工艺E.coli、CHO、Vero、MDCK、Sf9等不同工程细胞HCPs抗体覆盖率的检测分析。

昆虫细胞杆状病毒表达系统（IC-BEVS）是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行外源蛋白生产的真核表达系统。BVES具有易于规模化生产、培养成本低、生物安全性高等优势，近年来陆续被研究用于生产重组蛋白、rAAV载体、亚单位疫苗（如病毒样颗粒（VLP）疫苗）等， 在生物制品重组蛋白表达领域已有普遍运用。Sf9来源于草地夜蛾细胞系（Spodoptera frugiperda cell line，Sf），是目前较常用的昆虫细胞系之一。SHENTEK® Sf9 HCP残留蛋白检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法），可定量检测使用Sf9细胞系生产的生物制品中宿主细胞蛋白的残留检测。试剂盒抗体覆盖率为70.4%-96.0%（IMBS-2D）和91.2% (IMBS-MS，Unique Peptide ≥2）。

按照美国药典1132章节的要求，HCPs校准品需满足代表性要求，即能覆盖实际工艺产品生产中的HCPs。从HCP免疫检测方法使用目的和预期风险管理要求考虑，满足工艺开发和验证，同时为了应对下游工艺中潜在的异常工艺失效，或工艺变更需求，建议采用上游发酵工艺末端，如澄清处理后工艺点的样本作为HCPs的来源。在实际制备中，可采用空细胞或空载细胞在模拟实际工艺的预定条件进行采集，通过二维电泳或高分辨率质谱等蛋白质组学方法进行模拟工艺和实际工艺下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白种类越少，也越接近DS中HCPs，但是其可能无法满足工艺开发和验证需求，也无法保证工艺的潜在风险，往往不推荐使用，或只作为上游工艺HCPs免疫检测法的辅助使用。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli )又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。大肠杆菌是表达药用异源蛋白的常用微生物，在被批准的药用蛋白中，大约30%的产品以大肠杆菌作为表达宿主菌。与其他表达平台一样，尽管下游复杂的纯化步骤已经去除了大量的杂质，但终产品中仍会存在HCP残留风险，必须对其进行质量控制，使其符合放行标准。湖州申科生物E.coli表达菌HCP残留检测试剂盒用于大肠杆菌表达菌株BL21来源的宿主细胞蛋白定量检测，适用于重组蛋白类产品的工艺中间品和原液类样品，如白细胞介素（IL）、干扰素（rhIFN）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、肿瘤坏死因子（rhTNF）、促生长因子（EGF/FGF/PDGF）等。试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。