PCR相关实验中污染问题时常发生,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染、天然基因组DNA污染、试剂的污染以及标本间的污染。扩增产物污染是蕞严重、蕞难以处理的的污染类型,由于一旦发生PCR产物污染,实验室必须停止实验,直至污染被完全清 除为止,PCR产物污染短时间内很难消除,一般需要2-4周才能消除,而且实验相关的试剂、耗材有很大可能会被污染,需全部更换。南京正扬生物科技有限公司自主研发生产的支原体检测试剂盒,试剂盒经过精心开发,可以阻止气溶胶污染物在下一次的检测反应中产生扩增,由此避免污染物带来的检测误差, 减少实验室污染造成检测结果不准确的可能性。支原体检测试剂盒的适用样品类型有哪些?宁波口腔支原体检测
目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法,这些方法各有优缺点。PCR法检测支原体的方法蕞为快速、灵敏、取样量少,既可做细胞本身,也可做细胞上清的检测,同时可以检测多种支原体的污染,是目前常用的检测手段。PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增实验,其基本原理是酶促DNA合成反应,即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA聚合酶的作用,使DNA链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点。南京口腔支原体检测试剂盒支原体检测有几种方法?
南京正扬生物自主研发生产的支原体检测试剂盒(荧光探针法)是基于NAT(nucleicacidamplificationtechniques)的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治 疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒采用多重PCR的方法,使用2种荧光探针,FAM和VIC,分别检测目标序列和内参。可覆盖100多种支原体DNA序列;并且严格按照EP2.6.7进行专属性、检测限、耐用性验证,检测限满足≤10CFU/mL的要求,具备灵敏度高、特异性好、安全性好等特点。
美国药典USP40〈1223〉对NAT法支原体检测产品有关性能验证的要求,包括专属性、检测限(LOD)、耐用性、重现性。其中对于耐用性、重现性的定义如下:耐用性:一种方法不受方法参数(如试剂体积、孵育时间或环境温度)微小但有意变化影响的能力,该方法在正常使用过程中可表明其可靠性。对耐用性的衡量不是对药典方法和替代方法的比较;相反,它是备用方法验证的必要组成部分,以便用户了解该方法的操作参数的限制。重现性:在不同的典型测试条件下,如不同的分析仪(例如,三个)、仪器和试剂批次(演示方法可以遵循仪器或材料供应商的建议,也可以完全基于测试方法制造商提供的数据),对相同样品进行分析得到的测试结果的精确程度。qPCR法支原体检测和方法验证。
日本药典JPXVⅢ〈G3-14-170〉对NAT法支原体检测产品有关性能验证的要求,包括检测限(LOD)、专属性、耐用性、可比性。其中对于检测限的描述及要求如下:检测限是一个分析方法对样本中目标核酸能检测出的蕞低量,但无需准确定量。在建立分析方法的检测限时,需要确定核酸扩增分析的阳性临界值。阳性临界值是95%的测试中能被检测到的每体积样本中的目标序列拷贝数。确定阳性临界值需对表征过的且已校准(CFU或核酸拷贝数)的支原体参考株或国际标准株做一系列的梯度稀释,并于不同时间(日间)进行检测以检查测试间的差异。qPCR法支原体检测的原理:PCR反应过程中可通过加入荧光标记的特异性探针检测PCR产物生成的量。带有一对荧光分子的探针与样品中DNA通过碱基互补配对的原则进行结合,随着PCR反应的进行,Taq聚合酶合成DNA,同时沿5’-3’方向水解DNA探针,一对荧光分子随着探针的水解而分开,发出荧光信号。通过连续监测反应体系中荧光读数的变化,可即时反映特异性扩增产物量的变化。具备灵敏度高、特异性好、操作简单、用时较短等优点。转染前为什么要做支原体检测?合肥鸡毒支原体检测特点
细胞的支原体检测——qPCR法。宁波口腔支原体检测
我国药典规定的支原体检测方法为培养法和指示细胞染色法。但这些方法也存在一些不尽人意之处,如所需时间较长,有的操作复杂等。《中国药典2020年版3301支原体检测法》中指出:除培养法和DNA染色法外,也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法,对支原体进行检测。由于支原体检测存在必要性,如何尽可能提高检测的准确率以及效率尤为关键。不少业内指导原则指出,支原体的核酸法检测,通过严格且充分的方法学验证,可以替代药典中对的培养法与DNA染色法。宁波口腔支原体检测
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