上海动物试验ELISA试剂盒使用方法

钩状效应是高浓度抗原导致夹心法ELISA出现假阴性的典型现象。其发生机制是：当样品中抗原浓度异常高时，抗原分子会同时、过量地结合捕获抗体（固定在板上）和酶标检测抗体（在溶液中）。这导致大部分酶标检测抗体被溶液中的抗原结合，形成可溶性的“抗原-酶标检测抗体”复合物，在洗涤步骤被洗掉；而固定在板上的“捕获抗体-抗原”复合物由于缺乏游离的酶标检测抗体结合位点，无法形成完整的“三明治”结构。结果，实际参与显色的酶标物**减少，信号值反而低于中等浓度抗原样品，甚至接近阴性对照水平，造成严重低估或误判为阴性。识别钩状效应：对显色异常弱（与预期不符）的样品，特别是临床样本或阳性对照信号意外低时，应考虑此效应。细胞培养上清液需离心去除碎片后再检测。上海动物试验ELISA试剂盒使用方法

标准品（Standards）是ELISA定量分析的“尺子”。它是一系列已知精确浓度的目标抗原（或抗体）溶液，浓度梯度覆盖预期的检测范围（如0, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000 pg/mL）。标准品通常由高纯度的重组蛋白或天然纯化蛋白配制在含有保护剂（如BSA）的缓冲液中。用户需要严格按照说明书稀释（如果需要）并随样品一起进行检测。将标准品测得的信号值（OD值）对其浓度作图，即可绘制标准曲线（通常为四参数或双对数曲线）。通过这条曲线，才能将未知样品的信号值转换为浓度值。质控品（Quality Controls, QCs）则是已知浓度（通常在标准曲线范围内的高、中、低值）但浓度对用户保密的样品，用于监控整个实验过程的准确性和精密度。运行质控品是评估试剂盒性能和操作是否正常的重要手段。贵州人ELISA试剂盒销售价格检测范围过窄可能导致样本需要多次稀释。

竞争法（CompetitiveELISA）通常用于检测小分子抗原（半抗原），如***、药物、***等，这些小分子通常只有一个抗原表位，无法使用夹心法。其原理基于待测抗原（样品中）与标记抗原（通常酶标）竞争结合有限的抗体结合位点。有两种常见形式：·形式A(包被抗原)：1.包被已知抗原（非目标小分子，常为与目标分子结构相似的蛋白偶联物）。2.封闭。3.同时加入：待测样品（含未知量目标小分子）+固定量的酶标记特异性抗体。样品中的游离小分子与包被抗原竞争结合酶标抗体。4.洗涤：洗去未结合的酶标抗体（包括与游离小分子结合的）。5.加底物显色。

双抗体夹心法（SandwichELISA）是**常用、**灵敏的ELISA类型，特别适用于定量检测大分子抗原（如细胞因子、***、病毒蛋白、可溶性受体等），要求目标抗原至少具有两个不同的、空间上不重叠的表位。其**步骤如下：1.包被：将特异性捕获抗体固定在微孔板孔底（试剂盒中已完成）。2.封闭：加入封闭液封闭剩余位点（通常已完成）。3.加样：加入待测样品或标准品，目标抗原被捕获抗体特异性结合。4.洗涤：洗去未结合的样品成分。5.加检测抗体：加入酶标记的特异性检测抗体（识别抗原的另一表位），形成“固相捕获抗体-抗原-酶标检测抗体”三明治复合物。6.洗涤：洗去未结合的酶标检测抗体。7.加底物：加入酶的显色底物，酶催化反应产生颜色（或光/荧光）。8.终止与读数：加入终止液（如为HRP-TMB系统）停止反应，在特定波长（如450nm）下读取吸光度（OD值）。信号强度与样品中抗原浓度成正比。此模式特异性高，因为需要两个抗体的双重识别。常见的ELISA类型包括直接法、间接法和夹心法。

酶在ELISA中扮演信号放大器的角色。**常用的酶是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）。HRP催化过氧化氢（H₂O₂）氧化底物，常用底物是3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），氧化后产生可溶性蓝色产物，加入强酸（如硫酸）终止反应后变为黄色，在450nm波长处有比较大吸收峰。ALP则催化磷酸酯底物水解，常用底物如对硝基苯磷酸酯（pNPP），产物为黄色对硝基苯酚（pNP），在405nm处检测吸光度。HRP系统通常反应更快，灵敏度更高，但易受某些抑制物影响；ALP系统相对稳定，线性范围可能更宽。试剂盒中提供的底物通常是即用型或浓缩液，需按说明书配制。高质量的底物应能产生信号强、背景低、稳定性好的显色反应。ELISA试剂盒的保存条件通常为2-8℃避光。黑龙江动物试验ELISA试剂盒销售电话

试剂盒说明书应全程保存以供后续查阅。上海动物试验ELISA试剂盒使用方法

为了确保ELISA结果的准确性、精密度和可靠性，贯穿实验全程的质量控制必不可少：·内部QC(实验内)：o空白孔（Blank）：*含底物和终止液，用于仪器调零，扣除微孔板和试剂的背景吸光度。o阴性对照（NegativeControl,NC）：通常是不含目标分析物的基质（如缓冲液、阴性血清）。用于评估背景信号和非特异性结合水平。是设定Cut-off值的基础。o阳性对照（PositiveControl,PC）：含有已知量目标分析物的样品。用于确认试剂盒有效性和整个检测系统工作正常。其信号应明显高于阴性对照，且浓度应在预期范围内。o标准曲线：是定量的**。要求点分布良好，拟合曲线R²值高（通常>0.99），斜率、ED50等参数在合理范围。标准品应做复孔。o质控品（QualityControls,QCs）：**于标准品的、浓度已知（通常为低、中、高值）的样品。其测定值必须在预设的可接受范围内（如均值±2SD或厂家声明范围）。QCs是判断整板实验是否可接受的**重要指标。o复孔（Replicates）：样品和关键对照（如NC,PC,QC）应至少做双孔。计算平均值和变异系数（CV%），CV%应小于一定值（如<15-20%），表明精密度良好。上海动物试验ELISA试剂盒使用方法