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然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
技术应用通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测，还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具，将与谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。为什么各个抗体都要进行WB预实验？对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，与抗原更加有效的结合，从而获得特异性和非特异性背景之间差异的比较大化。每一个抗体都有其特性，因此我们必须通过WB预实验获得背景小，非特异性条带少的实验结果。代测细胞实验就找成都瑞普信！
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