广东Quantagene q225mxqPCR仪使用说明

染色质片段化——DN段化:细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。广东Quantagene q225mxqPCR仪使用说明

qPCR和dPCR:研究人员已经通过两种方式克服了定量PCR分析的挑战：实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)。qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)。通过监测PCR期间的荧光强度，可以比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单。先将样品分为多个PCR反应，每个反应多包含一个模板。然后通过对阳性和阴性反应进行计数来确定初始样品中模板分子的数量。尽管qPCR和dPCR都能够定量样品中的核酸，但它们有一个重要的区别。qPCR只能实现相对定量(例如，样品A的目标序列是样品B的目标序列的两倍)，除非使用此标准生成标准曲线。数字PCR本身是定量的，不需要标准曲线。另一方面，qPCR技术更加成熟和众所周知，市场上有大量商业产品可供选择。dPCR仍然是小的新鲜肉。它不如qPCR使用且价格昂贵。与dPCR相比，qPCR更适合于高通量分析，并且动态范围广。广东Quantagene q225mxqPCR仪使用说明为了增加qPCR实验可靠性、重复性，需要制定统一的实验标准来进行规范。

制备DNA——解交联和DNA纯化现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平在该步骤中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定位点。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 数据需要针对可变性来源进行标准化，包括染色质数量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据方法——Percent Input法和富集倍数法（Fold Enrichmen）。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准化。建议ChIP 实验重复，尽可能将结果与背景信号和标准误差一起显示。

qPCR的实质就是PCR反应，只是在扩增产物上增加了荧光标记，通过仪器对荧光信号进行采集。荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比，因此非理想条件下的PCR荧光强度Rn=R0+YnRs＝RB+Y0(1+Ex)^nRs （Rn：第n次循环时荧光信号强度，R0：背景信号强度，Rs：每个分子的荧光强度），通过对采集荧光信号就能进行初始模板定量、基因表达量的研究。通过对PCR过程中荧光信号的实时监测，荧光强度的变化趋势，呈现出一条S型曲线即“扩增曲线（Amplication plot）”，分为四个时期：基线期、指数扩增期、线性增长期、平台期。qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。

TaqMan探针法是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。TaqMan和SYBR Green I染料法为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可检测双链DNA，包括非特异性的反应产物。广东Quantagene q225mxqPCR仪厂家

根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。广东Quantagene q225mxqPCR仪使用说明

在扩增曲线上，指定某个荧光强度值时可对应得到达到这个值所需的循环数。选择合适的荧光强度值，该值的水平线可以切割到所有处于指数增长期的扩增曲线，这样的荧光强度值称为荧光阈值（threshold）。在荧光进入指数期初阶段的荧光强度值符合这一特点。一般PCR扩增的初始循环（默认3~15个循环），荧光信号变化不大，接近直线，称为基线（baseline），所以通常仪器默认的阈值是PCR反应~15个循环（荧光本底信号）的荧光信号标准偏差的10倍。当然，实际还需要结合PCR扩增效率、线性回归系数等综合考虑。也可以将阈值手动设置为大于荧光背景值和阴性对照（NTC）的荧光比较高值之间（进入指数期的初阶段）。广东Quantagene q225mxqPCR仪使用说明

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