华南地区单通道qPCR仪设置

TaqMan探针法是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。dPCR可用于常规qPCR所需的标准品定量，具有计量学意义 。华南地区单通道qPCR仪设置

染料法是指在qPCR反应体系中加入一种与双链DNA分子结合的荧光染料，包括SYBR®Green I、BEBO和LC Green TMI等染料，它们可以与双链DNA（double strands DNA，dsDNA）的小沟非特异性结合，激发较强的荧光产生。经荧光定量PCR仪器检测后，对核酸进行定性和定量分析。qPCR 染料法原理:这种方法的优点是，需要一对特异性引物，操作简单、检测成本低。缺点是由于荧光染料非特异结合dsDNA产物，无法正确区分目的产物，尤其是染料结合引物二聚体易产生错误的扩增曲线，易形成误判。虽然在PCR扩增程序后添加熔解曲线分析，可以方便判断生成的荧光扩增曲线是否属于目的产物，但是对于高灵敏度要求的实验来说，染料法并不是比较好的选择。华南地区单通道qPCR仪设置为了进一步确保荧光检测的就是靶DNA序列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合的荧光探针如TaqMan探针。

1983年，美国化学家Kary Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction， PCR)，这一技术将DNA聚合酶的特性结合核酸双链的变性复性特性，采用适温延伸、高温变性以及低温复性，让目的核酸片段实现了特异性体外扩增，可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而提高对DNA分子的分析和检测灵敏度。尤其是耐热DNA聚合酶的发现，更是极大地促进了PCR技术在分子生物学科研，及临床分子诊断领域的广泛应用。常用的 PCR 技术包括逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）等。

qPCR扩增效率100%的理想条件下的PCR反应，PCR产物量呈指数倍增长Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循环次数，Yn：第n次循环后的产物量）而实际PCR扩增时可能存在模板质量不佳引起的PCR扩增抑制，DNA聚合酶的种类及活性影响，非特异性扩增产物的竞争等情况，扩增效率无法达到100%。扩增初期，PCR产物指数倍增加，随着PCR产物的累积，各种影响因素的叠加，PCR产物不再指数倍增加，每个循环后产物增加量恒定，进入线性增长期，dNTP消耗殆尽，酶逐渐失活，扩增“停滞”，产物量恒定，进入平台期。非理想条件下的PCR反应：PCR产物量Yn=Y0(1+Ex)^n（Ex：扩增效率）。定量 PCR (qPCR) 允许对靶 DNA 进行相对定量，并且是一种可靠的、已建立的测试特定序列是否存在的方法。

1996年，美国ABI公司（现已并入ThermoFisher公司）推出首台荧光定量PCR检测系统，通过荧光定量PCR仪器实时接收扩增过程中荧光染料（或基团）释放的信号，对反应进行实时监控，进而产生相应的扩增曲线。在qPCR反应中，每个循环结束荧光染料（或基团）都会释放相应的荧光信号，这些信号与qPCR产物量成正比。qPCR扩增的阶段，分为扩增早期、指数期和平台期。在扩增早期，产物量很少，机器接收的荧光信号微弱可能会被覆盖；产物量逐渐增多反应进入qPCR指数扩增期，这个阶段可以通过指数期的某个点来对产物进行定量和计算起始的模板量；在扩增平台期，产物达到一定量，同时荧光信号趋于稳定。在qPCR反应中，可以通过不同循环阈值（Cycle threshold，Ct）区分扩增信号和背景信号，通过调节阈值实现定性和定量分析。根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。上海酷博qPCR仪

利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量准确，重现性比较好的定量方法，已得到全世界的公认。华南地区单通道qPCR仪设置

SYBR Green I染料法实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，激发荧光探针。荧光探针事先混合在PCR反应液中,只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成目的DN段的增加,结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光也相应增加。简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性的，以非饱和染料中常用的SYBR GreenI染料为例，这种荧光染料激发光波长520 nm,只能与双链DNA结合，与DNA双链结合时,荧光强度出现明显增大的非特异性染料。每形成一条DNA双链，就有相应数量的SYBR Green I染料嵌入并产生荧光，因此荧光信号强度变化与PCR产物浓度变化呈正相关，原理如图2所示。耀海在进行质粒拷贝数测定时采用qPCR染料法，即大肠杆菌克隆表达得到的质粒DNA，其菌种质粒拷贝数的测定采用荧光定量PCR法。以质粒中卡那霉素抗性基因序列为靶标基因设计扩增引物，建立基于SYBR的qPCR检测方法，用于某大肠杆菌菌种中质粒拷贝数的检测。华南地区单通道qPCR仪设置

广州双螺旋科学仪器有限公司总部位于广州市黄埔区锐丰三街4号617房，是一家仪器仪表批发;商品批发贸易（许可审批类商品除外）;商品零售贸易（许可审批类商品除外）;教学设备的研究开发;办公设备耗材批发;生物技术开发服务;生物技术推广服务;计算机批发;生物技术转让服务;农业科学研究和试验发展;医学研究和试验发展;自然科学研究和试验发展;水处理设备的研究、开发;食品科学技术研究服务;环保设备批发;办公设备批发;的公司。公司自创立以来，投身于数字PCR，纯水机，病理切片机，倍性分析仪，是精细化学品的主力军。双螺旋科学仪器继续坚定不移地走高质量发展道路，既要实现基本面稳定增长，又要聚焦关键领域，实现转型再突破。双螺旋科学仪器始终关注自身，在风云变化的时代，对自身的建设毫不懈怠，高度的专注与执着使双螺旋科学仪器在行业的从容而自信。