广东灵敏度qPCR仪仪器

PCR：Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线（amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。实时荧光定量PCR（QPCR）：一般用于检测样品中目的基因的表达量。广东灵敏度qPCR仪仪器

qpcr的检测原理：qPCR主要是使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，然后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析。qPCR 主要是依赖于标准品制备标准曲线，进而去确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。随着PCR的循环进行，染料荧光强度增加，从而检测到定量反应的DNA。SYBR Green是一种DNA插入染料，范围广用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。华南地区快速qPCR仪使用说明qPCR实现了通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

合成引物时需注意：在设计PCR引物时，首先确定要扩增的DNA区域，并设计一对专门位于目标区域的引物，一个在正向链上，另一个在反向链上。引物须具有特异性，避免扩增出非特异性片段。正向引物与反向引物应具有相似的退火温度，GC含量与退火温度相关，调整引物长度可以改变退火温度。避免引物序列有二级结构或引物二聚体，会降低PCR效率。许多的在线工具可用于辅助引物设计。PCR扩增包括三组被设定好的时间和温度，步骤为：变性，退火和延伸1、变性：PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95°C几秒钟，将两条DNA链分开，使它们之间的氢键迅速断裂。2、退火：反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但确切的比较好温度取决于引物的长度和顺序。不同的引物可能具有不同的退火温度。3、延伸：温度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常约为72°C。DNA聚合酶附着在每个引物的一端，并合成与模板DNA互补的DNA新链。

常规PCR中，PCR产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析；荧光定量PCR中，PCR反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR产物的实时检测成为可能。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；常规PCR的定量方法，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。而从图中可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR中Ct值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理论依据。dPCR比qPCR准确度与精密度高。

qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。其检测原理是荧光共振能量转移（FRET），即荧光基团和淬灭基团在目标DNA分子扩增过程中因为聚合酶的外切活性从而水解分离使荧光信号的释放；随着扩增过程的推进，机器实时检测增强的荧光信号，从而产生终的荧光扩增曲线。根据修饰基团标记和能量转移方式，可以将探针分为TaqMan探针、分子信标和其他探针。TaqMan探针（荧光淬灭水解探针）现今常用的TaqMan探针主要是水解探针，其多是5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团的短单链寡聚核苷酸。在qPCR反应中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，对TaqMan探针进行切割，使荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团发出的荧光信号不会被淬灭，释放的荧光信号被机器接收。TaqMan探针的qPCR相比于染料法多了一条TaqMan探针，可以特异性结合DNA序列，因而具有更好的特异性，但探针合成价格偏高。根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。珠三角节省qPCR仪供应商

实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。广东灵敏度qPCR仪仪器

阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔，体系中除了模板，包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。使用染料法进行qPCR实验时，首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果一致，要看两者Cq相差多少，比如，针对某一种引物的实验样品Cq值为28. 5，阴性对照的Cq值为33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的扩增效率计算，两者模板量相差28倍之多，对分析数据影响不大，所以实验样品的Cq值还是可以采用的；但是，如果两者的Cq值相差 1~2，这说明阴性对照中有较大的模板污染，则需要考虑更换试剂或引物，分区加样，重新实验。如果不一致，阴性对照主峰对应的Tm值小于阳性孔的Tm值，则可能是引物性能不好，无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体，这种情况则需要考虑更换引物，保证引物特异性以及扩增效率。广东灵敏度qPCR仪仪器

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