苏州医疗系统认证数字PCR分析应用

了解泊松分布，我们先要从二项式分布说起，二项式分布是一个离散概率分布，它给出了m次试验中k次成功的可能性，每次试验的概率为p，例如当掷骰子时，二项分布给出了在10次试验中恰好有7次掷出4的概率。在数字PCR的情况中，投掷骰子类似于将一个目标实体随机“投掷”到一组分区中，当目标落在选定的分区中时，就是成功。如果有n个分区，并且分区过程是完全随机的，则目标出现在所选分区中的概率为1/n。该试验重复m次，样品中的每个分子一次。如下所示的二项式分布给出了k个成功的概率，即所选分区恰好包含k个分子的概率。数字PCR通常采用大量分区。当n很大，并且尝试成功的概率(1/n)很小时，二项分布可以近似为泊松分布。dPCR的结果统计方式有2种，一种是采用标记多种颜色，另一种采用概率统计的数据处理方法。苏州医疗系统认证数字PCR分析应用

dPCR在使用过程中需要特别注意体积误差造成的结果偏差。体积误差对于测量拷贝数浓度会产生偏差。目前dPCR中体积优化方法以光学显微镜观测为主。分散体积的差异会增加拷贝数结果的不确定性，Emslie等使用光学显微镜纵向拍照比较图片边缘的微小差异，考察了数字PCR系统中每个微孔内和孔与孔间的体积差异对实验结果的影响程度。Corbisier等使用微滴数字PCR对6种不同质量分数棉籽粉质粒DNA标准物质[ERM-AD623a-f，浓度范围（10~10）copies/ul]进行分析，优化了液滴体积得到相应校正因子，并使用该校正因子发现并校准了运行软件中液滴体积不变的假设而引起的数据偏离，数据结果的一致性有明显提高。美国医疗系统认证数字PCR原理影响dPCR定量结果的因素：仪器采用的分散方式与数量、溶液稀释方法、分散体积的准确性以及结果表达方式。

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由于现有的商业化数字PCR设备在物理上只设置了2个检测通道，所以存在一个明显的短板：不能同时进行多个位点的检测。在样品多位点的检测中，就需要更多的起始样品，但临床上组织的样品非常有限。相比之下荧光定量PCR仪上就很容易实现多重检测。为了考察利用数字PCR实现多重检测的可能性，英国TheInstituteofCancerResearch的研究人员以非小细胞肺相关的KRAS基因为检测对象，在Bio-Rad的数字PCR系统上通过3个三重ddPCR检测体系来实现9个KRAS突变位点的检测。在dPCR中，样品被分区，使得样品内单个的核酸分子被定位并被集中在许多分离的区域内。

数字PCR实验步骤包括：1）试剂配制：将10xdPCRBuffer、dPCR酶、引物和探针、无核酸酶水混合成dPCR预混液，并分装到8联排管中或96孔板中；将各待测样本的核酸模板、阳性对照、阴性对照分别加入相应的8联排管中或96孔板中；2）芯片进样：在小海龟BioDigital·青全自动样品处理系统上进行芯片上反应液进样和液滴生成；3）芯片扩增：在小海龟BioDigital·青PCR扩增仪上进行芯片上PCR扩增反应；4）芯片阅读：在小海龟BioDigital·青生物芯片阅读仪上进行芯片上荧光信号阅读；5）数据分析：使用生物芯片数据分析·青软件进行数据分析和报告导出；通过不同cluster的位置进行突变位点的判断时存在误判的现象。苏州国产数字PCR价格

数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法。苏州医疗系统认证数字PCR分析应用

现有dPCR分析方法采用荧光探针和基于光的检测方法来鉴定扩增产物。这些方法要求足够的靶分子扩增以产生足以被检测到的信号，但可能会导致额外的错误或偏差，因此，希望能够提供一种改进的、用于检测样品内感兴趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的准确度和精确度，并且其具有可以与基于dPCR的方法关联使用的灵敏度。dPCR还在样品内进行单一反应，但是所述样品被分离成大量的分区(partition)，并且所述反应在每个分区中单独进行。这种分离允许对核酸量进行灵敏的测量。DPCR已被证明可有效用于研究基因序列中的变异，例如拷贝数变异或点突变。苏州医疗系统认证数字PCR分析应用

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