无锡Cryo-TEM技术应用

冷冻电镜技术：随着技术的不断进步和人类对于生命科学领域知识的不断积累，药物研发越来越走向理性化，包括法规体系的建立和优化、药品质量控制模式的变迁走向QbD阶段。基于结构的药物设计已经逐渐成为药物开发设计的主流，与此同时冷冻电镜技术也在蓬勃发展。冷冻电镜单颗粒分析技术和微晶电子衍射技术不只能解析近原子分辨率的结构，而且能解析传统结构生物学无法解析的结构，帮助确认药物靶点，拓展可用药物靶点的研究范围和完善基于靶点结构的药物设计。冷冻电子断层扫描技术在不久的未来可能提供细胞原位观察药物与靶点的作用。冷冻电镜技术能够揭示生物分子细节。无锡Cryo-TEM技术应用

冷冻电镜技术解析结构的一般流程是怎样的？对样品的要求是什么？冷冻电镜解析蛋白结构一般流程为：蛋白表达纯化；负染样品准备：约2小时完成；负染样品的数据收集：约8小时完成；冷冻样品的准备：约4小时完成；冷冻样品的数据收集：48-120小时完成。三维结构重建。冷冻电镜解析蛋白结构对蛋白质的要求：分子量：一般需要样品的分子量在200kD以上。缓冲液：缓冲液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有机物质，这些会降低样品的衬度，难以获得高分辨的三维结构。一般而言，缓冲液为20mMHepes，150mMNaCl。浓度：一般而言，可溶性蛋白浓度应在1mg/ml左右，膜蛋白应保证浓度在5mg/ml左右。体积：20ul足够（前提是需要蛋白浓度达标，做一个样品3ul左右）。均一性：分子筛行为表现为单一的峰，均一性大于90%。南通冷冻透射电子显微镜技术品牌冷冻电镜技术与X射线晶体学、核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。

冷冻电镜技术的独特优势：1、更接近天然状态：电子断层成像技术则可用来研究一定厚度的亚细胞器在天然状态下的内部结构，不需要蛋白质结晶。2、适用研究对象普遍：冷冻电镜单粒子法既可以对具有对称结构的大分子进行研究，也适合于研究结构不规则的大分子复合物，对于分子量的上限没有限制，理论上>100kD的分子在成像技术能够保证的情况下可以形成足够的对比以进行图像校正。冷冻电镜技术作为一种重要的结构生物学研究方法，它与X射线晶体学、核磁共振一起构成了结构生物学研究的基础。

冷冻电子显微镜技术在20世纪70年代时提出，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟，近年来已经进入了快速发展的时期。它的研究对象非常普遍，包括病毒、蛋白、肌丝、蛋白质核昔酸复合体、亚细胞器等。一方面，冷冻电微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的;而且对于样品的分子量没有限制。因此，很大程度突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量(小于100KD)样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克了因化服学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。冷冻电镜技术，是用于扫描电镜的很低温冷冻制样及传输技术。

单颗粒冷冻电镜技术的颗粒挑选：接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。半自动和全自动的方法主要有以下三类：(1)通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。(2)基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。(3)结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。冷冻电镜技术主要研究组织、细胞和微生物中的超微结构。莆田冷冻电镜单颗粒技术服务中心

冷冻电子显微技术学解析生物大分子及细胞结构的中心是透射电子显微镜成像。无锡Cryo-TEM技术应用

冷冻电镜技术基本原理之三维冷冻电镜技术：样品经过在液氮中的冷冻固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃态的形式存在，保持低温，将样品放入显微镜，高度相干的电子作为光源从上面照射下来，透过样品和附近的冰层，受到散射，利用探测器和透镜系统把散射的信号成像记录下来，再进行信号处理，较后利用三维重构的技术得到样品的三维结构。冷冻电镜技术的独特优势分辨率高：光学显微镜的分辨率为0.2μm，透射电子显微镜的分辨率为0.2nm，透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。无锡Cryo-TEM技术应用