武汉单颗粒冷冻电镜技术平台

冷冻电子显微镜技术之样品成像：低剂量辐照成像，普通的样品材料在进行TEM表征时，电子剂量越高，成像质量越好。但生物样品受到的辐照损伤却是和累积的辐照总剂量相关的。更详细一点说，随着辐照剂量的增加，辐照损伤对高分辨细节的破坏更严重。因此，为了尽可能地获得更多的细节，就必须要对样品采用用低剂量辐照成像。在冷冻电镜技术中，常用的低剂量辐照成像法有两种：冷冻电子断层扫描法，单颗粒分析成像法。冷冻电镜技术中的电子断层扫描技术（cryogeniccomputedtomography）：进行断层扫描时，样品被连续不停地旋转，并在每个旋转角度上都进行一次成像。每一幅电子显微像是物体在不同投影方向的二维投影像,经傅立叶变换会得到一系列不同取向的截面，当截面足够多时，会得到傅立叶空间的三维信息，再经傅立叶反变换便能得到物体的三维结构。冷冻电镜技术中的单颗粒分析法理论成像分辨率更高。武汉单颗粒冷冻电镜技术平台

冷冻电镜技术未来之路在何方?除了蛋白等生物大分子外，生物样品还有很重要的一面是细胞和组织。即使是目前有很多重要的蛋白结构都得到了埃米级别的解析，但由于它们都是纯化出来的，已经脱离了原来位置，就如同一片树叶脱离了大树，研究的再深刻，目前也只是一叶遮目，不要说推测这片树叶在森林里的位置，即使是在哪颗特定大树上的生长部位和结构都很难说。因此解析细胞或组织这样大尺度的高分辨精细结构具有更普遍的生物学意义。武汉单颗粒冷冻电镜技术平台冷冻电镜技术的独特优势：冷冻电镜单粒子法既可以对具有对称结构的大分子进行研究。

冷冻电镜技术中的单颗粒分析法（Singleparticleanalysis,SPA）：单颗粒技术获得投影的具体方法：制备很多具有同样结构的大分子样品，将其进行分散冷冻后进行随机的投影拍照，再通过计算模拟测定角度，对具有相同角度的粒子进行组合，突出其中更特殊、更容易解释的特征。单颗粒冷冻电镜是针对单个粒子进行重构的技术，但我们的研究对象往往是多构象或结构异质的蛋白，颗粒之间存在细微差别，这是一些蛋白质无法获得高分辨结构的重要原因之一。对于结构异质性样品的分析，我们需要首先将样品分成几个同质的子集，然后分别进行三维重建。由于单颗粒分析法理论成像分辨率更高，尤其在分析具有同质性结构的样品时表现出更方便、更优异的成像能力，因此得到了更普遍的应用。单颗粒分析法的研究对象可以是具有某种对称性的颗粒，也可是不具有任何对称性的蛋白分子或复合体，尤其是针对核糖体的表征。

单颗粒冷冻电镜技术样品的筛选和数据采集：在开始高分辨数据采集前，可以利用冷冻电镜先对样品质量进行评估，包括但不限于蛋白浓度、稳定性和分布，冰层厚度、质量和载网各处的均一性等的检查。用户可以在120kV电镜或200kV电镜上进行此筛样过程。待到样品通过筛选，用户可以利用300kV或200kV电镜采集更大的数据量来帮助开展2D和3D分析。200kV-TalosArctica透射电镜配备了直接电子探测相机FalconIII,在样品质量较高时，较高可以获得<3Å的数据。目前的300kV-TitianKrios透射电镜有两套，其中一台配备了目前行业前列的K3直接电子探测相机，另一台配备有K2相机和能量过滤器，两套电镜均能够进行全自动、长时间无人照看的数据收集操作，可实现样品的大规模数据采集，并获得极高分辨率的结构信息。收集得到数以万计的单颗粒物照片后，用户可以使用平台集群已安装的常用三维重构计算软件以及相关生物软件对数据集进行计算处理。冷冻电镜技术的基本原理是将生物大分子溶液置于电镜载网上形成一层非常薄的水膜。

冷冻电镜技术基本原理之三维冷冻电镜技术：样品经过在液氮中的冷冻固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃态的形式存在，保持低温，将样品放入显微镜，高度相干的电子作为光源从上面照射下来，透过样品和附近的冰层，受到散射，利用探测器和透镜系统把散射的信号成像记录下来，再进行信号处理，较后利用三维重构的技术得到样品的三维结构。冷冻电镜技术的独特优势分辨率高：光学显微镜的分辨率为0.2μm，透射电子显微镜的分辨率为0.2nm，透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。冷冻电镜技术采用的快速冷冻技术关键在于“快速”。荆州冷冻透射电子显微镜技术应用

冷冻电镜技术能够从分子层面进行详细的研究，解析基于结构的药物研发的分子基础。武汉单颗粒冷冻电镜技术平台

低温冷冻透射电镜技术的特点：相对于常温透射电镜，低温透射电镜的优势有：①快速冷冻制样技术将样品固定在玻璃态的冰层中，避免了水或溶剂结晶对样品结构的破坏，能够保持液相中有机分子自组装体和化学反应中间体的微观结构，避免了样品干燥引起的结构变化;②高分子及化学反应体系常常具有非平衡态结构，快速冷冻制样技术能够保持住非平衡态结构，进而得以观察;③低温条件能够尽可能保持有机和高分子等软物质材料的微观结构，明显减少电子束对样品的损伤。武汉单颗粒冷冻电镜技术平台