复制性慢病毒/复制性逆转录病毒检测的必要性:RCL/RCR会同逆转录病毒载体一样,整合在细胞基因组中,从而产生因整合导致的原ai基因激 活,抑ai基因破坏或者使促细胞生长的因子高度表达而造成二次仲瘤的风险。因其具有复制性,即产生具有复制能力的病毒,增加了因整合而造成的二次仲瘤的风险。虽然目前在病毒制备体系方面改进很多,很大程度上降低了RCL/RCR产生的风险,但是仍不能完全排除,美国FDA要求对于γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体,需要在整个生产过程及不同阶段进行RCL/RCR检测,需要对载体生产用主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、载体上清液及在体外培养超过4天的载体转到细胞进行检测,复制型慢病毒检测的法规监管要求。杭州RCR病毒检测操作流程
慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV-1)为基础发展起来的基因医治载体,属于逆转录病毒家族,又区别于一般的逆转录病毒载体,比逆转录病毒载体具有更强的感 染能力,具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合、持久表达、免疫反应小等优点,是常用的基因转移载体。而载体作为基因医治的工具,可能带来插入突变、复制型病毒、外源因子污染等风险,同时其携带的遗传物质是CAR-T细胞的重要组成部分,是使T细胞具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞活性的重要基础,考虑到病毒载体技术的广泛应用,具有复制能力的慢病毒/逆转录病毒检测成为重要问题,FDA及欧盟先后出台相关文件,要求建立灵敏、可靠的复制能力的慢病毒/逆转录病毒检测方法。郑州RCL病毒检测为什么要做复制型逆转录病毒检测?
CAR-T细胞的微生物安全风险可能涉及细菌、真 菌、支原体、外来病毒和来自载体生产的具有复制能力的病毒的污染。微生物安全问题需要高度关注,因为在生产过程中很容易发生微生物污染,而且蕞终的细胞产品无法净化。CAR-T细胞的微生物安全主要通过对生产材料的严格检测、按照CGMP要求严格控制生产过程、对产品进行微生物检测来保证,检测内容包括无菌检测、支原体检查、可复制型病毒检测、微生物检测。南京正扬生物目前可提供支原体快检和可复制型病毒检测相关产品。
国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)发布了《体内基因治 疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》,对基因治 疗产品的质量属性分析给出了指导意见,强调基于质量研究和关键质量属性(Criticalqualityattributes,CQA)的鉴别建立完善的质量控制策略,常见的质量研究项目包括但不限于鉴别、结构分析、生物学活性、纯度、杂质、含量、转染/感 染效率、一般理化特性等。rcAAV复制型腺相关病毒作为生产过程中的工艺杂质,其限度尚未有明确的标准要求,行业普遍建议rAAV病毒原液或终产品(比原液多了分装的工艺)中的rcAAV的含量应小于1rcAAV/10⁸rAAVvectorgenome,因此必须采用高灵敏度的方法才能对其进行检测和定量分析。目前rcAAV复制型腺相关病毒检测常采用2种方法,即基于细胞培养的检测方法和qPCR快检法。qPCR法复制型慢病毒检测的优点有哪些?
qPCR法RCL/RCR病毒检测:目前许多CAR-T企业采用Q-PCR方法直接测定CAR-T终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列,因考虑到CAR-T细胞种产品一般需要新鲜输注的特殊情况,基于细胞培养法的RCL/RCR检测方法周期较长,建议在细胞产品制备过程中进行多面控制(如对慢病毒载体及生产终末细胞采用基于细胞培养方法测定RCL/RCR,以确保生产工艺过程中不存在RCL的风险),细胞终产品阶段可采用qPCR检测法快速放行。qPCR法RCL/RCR病毒检测:目前许多CAR-T企业采用Q-PCR方法直接测定CAR-T终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列,因考虑到CAR-T细胞种产品一般需要新鲜输注的特殊情况,基于细胞培养法的RCL/RCR检测方法周期较长,建议在细胞产品制备过程中进行多面控制(如对慢病毒载体及生产终末细胞采用基于细胞培养方法测定RCL/RCR,以确保生产工艺过程中不存在RCL的风险),细胞终产品阶段可采用qPCR检测法快速放行。。南京正扬有复制型腺相关病毒检测试剂盒吗?RCR病毒检测产品
复制型慢病毒检测请联系南京正扬。杭州RCR病毒检测操作流程
《CAR-T细胞治 疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到:目前RCR/RCL病毒检测方法主要有指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)和转录酶活性测定法(PERT)等。其中,利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒(上清液、病毒生产终末期细胞)存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行重复检测是FDA推荐的RCL检测方法。
《CAR-T细胞治 疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到:目前RCR/RCL病毒检测方法主要有指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)和转录酶活性测定法(PERT)等。其中,利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒(上清液、病毒生产终末期细胞)存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行重复检测是FDA推荐的RCL检测方法。 杭州RCR病毒检测操作流程
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