复制型病毒/病毒载体回复突变(ReplicationCompetentVirus,RCV),可产生于病毒载体制造过程中的所有步骤当中。并且,RCV感 染宿主细胞后能随宿主细胞在培养液中增殖、扩增对人体健康具有严重的隐患,是免疫细胞治 疗类产品,如CAR-T产品的主要安全性风险之一。近年来,CAR-T细胞制备过程中,伴随载体的不断升级优化,重组产生的复制型逆转录病毒/慢病毒(ReplicationCompetentRetrovirus/Lentivirus,RCR/RCL)逐渐降低,但产生RCR/RCL的风险隐患至今仍不能完全排除。由2022年5月发布的《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)》指出RCR/RCL检测作为安全性检测在细胞药物的研发和生产过程中至关重要,相关产品不得检出RCR/RCL,可知病毒载体相关产品中,RCR/RCL病毒检测至关重要。qPCR法复制型慢病毒检测的工作流程。合肥复制型慢病毒检测特点
RCL/RCR病毒检测的方法FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行检测。•扩增期:将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系(通常用C8166)孵育,细胞传代5次以上,培养至少3周。•指示期:3周后收集培养上清,接种于C8166细胞中培养7d后检测RCL标志物。•检测:A:P24ELLISA的方法:适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成RCL的检测。B:PERT法:当RCL进行扩增后,也可应用PERT检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。C:qPCR方法:采用实时定量PCR方法(Q-PCR)测定假型病毒杭州RT-PCR法病毒检测服务南京正扬有复制型逆转录病毒检测试剂盒性能如何?
采用何种方法进行RCR/RCL病毒检测?复制型病毒(RCR/RCL)是γ-逆转录病毒载体与慢病毒载体的一个安全性质量控制项目,因病毒载体设计的不同,产生复制型病毒的风险也会有不同,如采用四质粒共转体系以及含有末端自我失活(SelfInactivating,SIN)结构的病毒载体,其病毒载体生产过程中产生RCL的风险会明显降低,但尽管如此,产生RCR/RCL的风险仍不能完全排除,因此仍需要对病毒载体进行RCR/RCL的检测,且病毒载体不得检出RCR/RCL。
RCL复制型慢病毒检测:鉴于RCL的潜在威胁,从慢病毒载体生产工艺的各个环节:主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)、终末端细胞(EOPC)、慢病毒收获液(UPB)、转导细胞甚至CAR-T治 疗病人的临床样本都需要进行严格的质控检测来核实是否存在RCL,从而可以大限度地避免病人因CAR-T治 疗发生二次肿 瘤。复制型慢病毒RCL的指示细胞培养法检测需28天,耗时较长;而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有检测时间短、灵敏度高、可重复性强等优点。目前,许多CAR-T申报企业采用Q-PCR/PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列,作为快速放行方法。复制型腺相关病毒检测方法有哪些?
《CAR-T细胞治 疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到:目前RCR/RCL病毒检测方法主要有指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)和转录酶活性测定法(PERT)等。其中,利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒(上清液、病毒生产终末期细胞)存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行重复检测是FDA推荐的RCL检测方法。
《CAR-T细胞治 疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到:目前RCR/RCL病毒检测方法主要有指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)和转录酶活性测定法(PERT)等。其中,利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒(上清液、病毒生产终末期细胞)存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行重复检测是FDA推荐的RCL检测方法。 复制型慢病毒检测的法规监管要求。南京病毒检测优缺点
南京正扬的重组腺相关病毒检测试剂盒的装量是多少?合肥复制型慢病毒检测特点
南京正扬生物科技有限公司自主研发生产的rcAAV复制型腺相关病毒检测试剂盒有哪些优点?①试剂盒经过独特的设计开发,可以防止PCR产物污染;②产品检测灵敏度高;③重复性好,同一样品重复检测20次,CV<15%;④检测时间短,从样品提取纯化到出结果只需2.5h;⑤适应性强,针对不同机型,不同实验室条件,检测结果稳定;⑥可提供自动化服务,自动化完成样品核酸提取纯化;⑦货期短,供应快;
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