LY6G免疫组化

细胞和组织样品处理：准备荧光标记的细胞样品：为实现较佳的图像质量，首先应建立针对目的蛋白和细胞结构的研究，同时将其他一切背景等排除在图像之外。固定和破膜细胞样品用于标记–首先将细胞结构、蛋白和核酸固定，然后使荧光染料和抗体渗入到细胞内部，标记目的靶点。封闭细胞样品，防止荧光标记物与研究无关的蛋白非特异性结合，较大限度提高信噪比。蛋白封闭液有助于减少非特异染色。抗体能够取代封闭蛋白与其表位形成高亲和力结合，而封闭液可防止样品中的低亲和力结合。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。LY6G免疫组化

细胞的固定及免疫荧光：注意事项：（1）取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。（2）种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。（3）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。（4）细胞爬片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。或者放于暗盒内，暂时保存于4度冰箱，尽快拍照。（5）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。PD-1免疫免疫荧光技术通过荧光信号的观察来确定抗原或抗体的分布和定位。

其他荧光物质：1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜。

免疫荧光的原理：免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。直接法:将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。免疫荧光技术可以用于研究代谢疾病和内分泌系统的功能。

荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）。发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有较大吸收峰和较大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的较大吸收峰波长，且测定光波量接近于较大发射光波峰时，得到的荧光强度也较大。免疫荧光技术可以用于研究动物模型和药物筛选。CRT(Calreticulin)免疫组化IHC

免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的亚细胞定位。LY6G免疫组化

细胞免疫荧光步骤是什么呢？步骤：1. 细胞一定要贴在玻片上（较好可以放入24孔板），为后面照像打基础。细胞密度适中，大约60-75%满片即可，否则容易脱片。2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。（以下各步骤切毋使玻片干燥）3. PBS冲洗；4. 0.1%Triton作用20分钟；5. PBS冲洗；6. 10%正常血清封闭10分钟；7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗体从较高处落到片子上，以分布均匀。抗体稀释度1：60，较常用！8. PBS冲洗4次，各5分钟；9加入荧光二抗，室温30分钟。抗体稀释度1：400，较常用！10. 90%甘油封片。也很关键阿，多封几次才有体会。12. 避光保存，或到显微镜下观察。LY6G免疫组化