IBA-1免疫

细胞免疫荧光主要用于蛋白定位研究和细胞内信号转导，细胞免疫荧光技术是利用免疫技术和荧光标记技术相结合，原理就是利用抗原-抗体反应之后，采用荧光标记，标记完成后，显微镜下观察细胞内某种抗原成分的多少，从而做出一个定位研究，也可以为细胞内信号传导提供一个明确的指导，细胞免疫荧光具有敏感性强、特异性高、速度快的特点，是目前比较常用的组织学技术，也是比较精确的。免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。免疫荧光技术利用荧光染料标记的抗体与目标分子结合，从而实现可视化检测。IBA-1免疫

荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度；荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。MMP13免疫组化使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。

免疫荧光实验的注意事项：对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。

荧光抗体技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光测定：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。免疫荧光实验步骤：直接法测抗原：基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用，帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。

细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。7. 较好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。IBA-1免疫

免疫荧光在医学诊断中起着重要作用，可以用于检测病原体、肉瘤标志物等。IBA-1免疫

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。IBA-1免疫