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基于荧光成像的技术对于查询细胞和组织的结构和功能方面非常有用。当与免疫化学结合时,荧光成像技术的分析能力增加,增强了这种技术在普遍的研究和临床应用中的实用性,使其成为宝贵的工具。免疫荧光显微镜通过使活细胞成像能够可视化整个细胞器,彻底改变了细胞生物学领域。免疫组织化学和免疫细胞化学是结合抗原抗体结合能力进行细胞分析的常用荧光成像技术。免疫荧光(IF)是一种强大的免疫染色技术,利用显微镜观察与靶蛋白和其他目标分子结合的荧光素标记抗体。免疫荧光用于鉴定细胞中的细胞和组织特异性抗原;可视化蛋白质的存在与否、细胞定位和活化状态;并分析免疫反应。免疫荧光技术可以用于研究细胞迁移和细胞黏附。HAND1免疫检测

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其他荧光物质:1.酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2.镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器:荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜。COL-1免疫荧光免疫荧光技术可以用于研究细胞内分子的相互作用。

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免疫荧光的制作:样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等):对于贴壁细胞:先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。对于悬浮细胞:有2种方法,①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。

注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555nm,发绿光;CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发红光)。两种抗体同时孵育:由于FIT容易萃灭,因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫荧光技术可以通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号,从而确定目标分子的存在和位置。

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荧光标记二抗的选择普遍;与使用荧光素结合一抗的检测相比,成本较低。间接免疫荧光的缺点:由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体,因此物种交叉反应性问题增加;与直接免疫荧光相比,时间更长(操作步骤更多)。间接免疫荧光的优点:通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大;与直接免疫荧光相比,通过信号放大提高检测灵敏度;荧光标记二抗的选择普遍;与使用荧光素结合一抗的检测相比,成本较低。间接免疫荧光的缺点:由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体,因此物种交叉反应性问题增加;与直接免疫荧光相比,时间更长(操作步骤更多)。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。PDX-1免疫荧光分析

免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用,帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。HAND1免疫检测

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。在此基础上又分为两种方法:直接法和间接法。直接法:将标记的特异性荧光抗体直接加到抗原上,经过一定时间反应,即可结合并显色。间接法:先用抗原的抗体(一抗)与抗原反应结合,再用荧光标记的二抗(一抗的抗体)与抗原反应,形成抗体-抗原-抗体复合物。HAND1免疫检测

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