Real-time PCR：基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是2-△△Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。实时荧光定量PCR...

引物的设计注意事项：1，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。2，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。Real-time PCR在实验过程中注意避免mRNA的断裂。南京分子生物学荧光PCR服务Real-time PCR式反应准备：10×扩增缓冲液、4种dNT...

Real-timePCR的反应条件：dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度。因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以...

Real-time PCR与普通PCR的实验目的不同，所以对引物的设计要求也不同。普通PCR的实验目的只是为了获得目的基因产物，允许有非特异扩增，只要目标条带清晰明亮，就可以通过切胶回收的方法回收目标条带，之后进行后续的克隆、测序。但Real-time PCR的目的是为了让目的基因按照理论值或是按照接近理论值进行扩增，只有这样的扩增后续由Ct值推算出的起始量模板量才准确，基于此，Real-time PCR对非特异性扩增和引物二聚体的存在有较严格的要求。因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。上海血液荧光PCR研究方案引物的设计对于这个实验至关重要，因...

Real-time PCR-传统定量PCR：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。Real-time PCR利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程。连云港微量PCR检测技术服务聚合酶链式反应（PCR）是...

聚合酶链式反应又称多聚酶链式反应，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DN段的核酸合成技术。透过这项技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链反应是是一种简单，廉价和可靠的方法复制DN段，这个概念适用于现物学和相关科学的许多领域。PCR可能是分子生物学中使用很较广的技术。这种技术被用于生物医学研究，犯罪取证和分子考古学。通常，PCR由一系列20-40次重复的温度变化组成，称为热循环，每个循环通常由两个或三个离散的温度步骤组成。聚合酶链式反应准备：引物内部不应出现互补序列。聚合酶链式反应的模板的取材主要依据PCR的扩增对象。连云港实时RT-PC...

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等；2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA晶片或差显结果的确证；3.基因分型：例如SNP检测，甲基化检测等。Real-time PCR常用的两种方法分别为Sybrgreen（萤光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）。Real-time PCR提高实验的重复性。连云港组织数字PCR服务聚合酶链反应同时扩增单个精...

Real-time PCR：使用Real-time PCR进行基因检测,被普遍应用于病毒和病原菌检测、转基因食品检测、遗传病基因检测等领域。一般首先需要利用专业使用的试剂盒从待检样品中提取其核酸（DNAorRNA），并经过精制等复杂的操作（通常称为前处理操作）之后才可以进行Real-time PCR。不易受反应阻害物的影响，使用时不需要进行复杂的前处理操作，单单需将待检样品直接加入到检测试剂中即可开始检测。通过使用本产品，可以在更短的时间内，简便、低成本地进行Real-time PCR检测。聚合酶链反应为这些技术提供了大量的纯DNA，有时是单链的。苏州骨头RT-PCR检测技术原理及步骤聚合酶链...

Real-time PCR探针法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报...

Real-time PCR原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。DNA结合染料法，应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚体。可对任何双链DNA进行定量；不需要探针，因此减少了实验设计及运转成本；适合于大量基因的分析；简单易用。实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环...

所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行...

Real-time PCR的染料法和探针法的选择：进行mRNA表达量的测定，采用染料法是比较经济实惠的；染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况；目的基因和内参基因分管检测，染料法可以选用Realtime染料PCRPreMIX，探针法主要应用于病毒RNA的检测；以及单位点突变（SNP）；多基因的合并检测，探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况；而染料法则必须分管检测。Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称Real-time PCR）是在定性PCR技术基...

聚合酶链反应同时扩增单个精子中几个基因座的能力增强了极大地增强了通过研究减数分裂后染色体交叉来进行基因定位的传统任务。通过分析数千个单个精子，已经直接观察到非常紧密基因座之间罕见的交叉事件。类似地，可以分析异常的缺失、插入、易位或倒位，所有这些都无需等待(或支付)漫长而艰苦的受精、胚胎发生等过程。定点突变：聚合酶链反应可用于产生突变基因，突变由科学家随意选择。可以选择这些突变来理解蛋白质是如何完成其功能的，并改变或改善蛋白质功能。聚合酶链式反应的模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、菌类等。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一...

Real-time PCR链式反应：每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不但操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。多重连接依赖探针扩增允许用单个引物对扩增多个靶标，从而避免多重PCR的分辨率限制。引物的设计注意事项：1，注意引物设计好后的产物长度。Real-time PCR的较佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持...

Real-time PCR式反应准备：10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物（终浓度）、引物（终浓度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（终浓度）、补加双蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上表格只提供大致参考值。PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DN段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高...

聚合酶链式反应生物学研究的历史中占据了重要的地位。以此为基础发展出包括Real-time PCR在内的多项应用技术。自诞生后Real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，Real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。主要是因为SDS软件采用整个平台较终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的数据，有些设备则不需要。前一种设备允许软件实...

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DN段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到2013年，PCR已发展到第三代技术。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团。盐城血液荧光PCRReal-time PCR：所谓Real-time PCR技术，是指在P...

Real-time PCR萤光染料掺入法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR萤光染料，SYBR萤光染料特异性地掺入DNA双链后，发射萤光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何萤光信号，从而保证萤光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法适用于：1、灵敏度高：使用SYBR可使萤光效果增强到1000倍以上。2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。4、高通量大规模的定量PCR检测。5、专一性要求不高的定量PCR检测。实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的。宁波特殊样本荧光定量PCR服务Real-time PCR原理：基...

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。...

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反应体系中加入荧光物质，然后通过荧光化学物质监测每次PCR反应循环后产物总量的方法，之后通过内参法或外参法对待测样品中的特定DNA序列（目的基因）进行定量分析的方法。实验过程中，这些荧光物质可以在激发光的作用下释放出一定波长的发射光，定量用PCR仪通过对这些发射光进行实时监测，较终可以描绘出整个PCR的反应过程，这就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR链式反应：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复...

Real-time PCR实验注意事项-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套...

Real-timePCR技术服务聚合酶链式反应的试验污染：实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。污染的监测：一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重复性试验。选择不同区域的引物进行PCR扩增。因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。徐州组织定量PCR网站Real-ti...

聚合酶链式反应又称多聚酶链式反应，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DN段的核酸合成技术。透过这项技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链反应是是一种简单，廉价和可靠的方法复制DN段，这个概念适用于现物学和相关科学的许多领域。PCR可能是分子生物学中使用很较广的技术。这种技术被用于生物医学研究，犯罪取证和分子考古学。通常，PCR由一系列20-40次重复的温度变化组成，称为热循环，每个循环通常由两个或三个离散的温度步骤组成。聚合酶链式反应准备：引物内部不应出现互补序列。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团。常州血液...

Real-time PCR链反应的常见问题分析与解决方法：反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。引物量过多。减少反应体系中引物的用量。模板量过多。质粒DNA的用量应

聚合酶链反应注意事项：在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；内参的设定主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA；在可...

引物的设计对于这个实验至关重要，因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。Real-time PCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。聚合酶链反应是是一种简单，廉价和可靠的方法复制DN段。无锡分子生物学PCR检测技术应用Real-timeP...

Real-time PCR：基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是2-△△Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。Real-time...

Real-time PCR：使用Real-time PCR进行基因检测,被普遍应用于病毒和病原菌检测、转基因食品检测、遗传病基因检测等领域。一般首先需要利用专业使用的试剂盒从待检样品中提取其核酸（DNAorRNA），并经过精制等复杂的操作（通常称为前处理操作）之后才可以进行Real-time PCR。不易受反应阻害物的影响，使用时不需要进行复杂的前处理操作，单单需将待检样品直接加入到检测试剂中即可开始检测。通过使用本产品，可以在更短的时间内，简便、低成本地进行Real-time PCR检测。实时荧光定量PCR以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。连云港血液荧光PCR...

所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。实时荧光定量PCR以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的...

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。...