上海Piezo Micro Manipulator压电辅助孵化

以piezo操作系统为技术支撑，在掌握小鼠卵母细胞胞浆内精子注射技术(ICSI)的基础上，进行了ICSI技术生产试管小鼠及转基因小鼠的尝试。实验结果表明以Hepes-CZB+3％蔗糖做操作液，用来自成年KM鼠附睾尾的新鲜精子头和pEGFP-N1质粒孵育处理冻融精子头，直接注射到B6D2F1小鼠卵母细胞质中，注射后1h，83.3％的卵母细胞仍然存活，鲜精组和冻精组各有92.3％和83.0％成活卵子排出极体、出现原核。用CZB溶液继续培养ICSI胚胎，两组的卵裂率、桑椹胚率、囊胚率分别为(97.8％vs94.7％)、(64％vs64.5％)、(5％，vs24.7％)。其中桑椹胚率、囊胚率均***低于体内受精对照组(64％，64.5％vs88％；5％，24.7％vs70％P＜0.01)；将鲜精组原核期120枚胚胎和82枚2-cell胚胎及冻精组135枚原核期胚胎移植后移植到同期km假孕母鼠受体内，分别出生28只、3只、18只ICSI小鼠(黑色或灰色)，效率分别为23.3％，4％，13.3％。健康成年的31只ICSI小鼠，没有明显的生理和行为异常。随机抽取六对鲜精组性成熟ICSI小鼠做交配实验，一个月后都有小鼠出生(平均窝产10.7只)。本实验表明，ICSI精子载体法可以比较高地制造小鼠转基因胚胎，小鼠附睾新鲜精子及无抗冻剂保护冷冻致死精子都具有足够的全程发育潜力。使用压电破膜仪 PMM PIEZO-ICSI进行人工受孕，可以减少操作的复杂性和风险，提高受孕成功率。上海Piezo Micro Manipulator压电辅助孵化

下面我们利用压电陶瓷测试压电效应和逆压电效应。常用的压电陶瓷是由锆钛酸铅（PZT）材料做成的。将PZT材料做成的压电陶瓷片粘在圆形黄铜片上就构成了压电陶瓷元件。它具有明显的压电效应。首先，将压电陶瓷片A的两根引线通过一个按钮开关与信号发生器相联。将压电陶瓷片B的两根引线与扩音器（带喇叭）的输入端相连。将A、B两个压电陶瓷片用黑封泥固定在同一个木板制成的箱子上。当观察者将按钮开关按下，接通信号发生器和压电陶瓷A时，由于逆压电效应，A开始振动，并把振动传给木箱，木箱的振动传给压电陶瓷B，由于压电效应，使B两边产生变化电信号，再传给扩音器使喇叭发声，所以这个实验同时演示了压电效应和逆压电效应。武汉压电ES注射Piezo-ICSI 相比常规 ICSI方法，可有效提高ICSI受精率。

已有的流行病学研究显示，单精子胞浆注射技术(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)可能导致出生小孩泌尿系统疾病的发生率增加.印记基因印记状态的改变与泌尿系统疾病相关，而ICSI操作正是发生在印记基因甲基化重新建立的关键时期，所以本研究的目的是研究ICSI技术对小鼠肾脏印记基因表达及甲基化状况的影响，从分子水平上研究ICSI技术对子代泌尿系统的影响，建立ICSI小鼠模型，以2-细胞移植组和自然妊娠组为对照，分别取10周，1.5年小鼠肾脏，用real-timeRT-PCR的方法测定h19,igf2,mest,peg3和snrpn的mRNA表达水平，对h19和snrpn进一步用亚硫酸盐测序方法测定甲基化水平.我们的结果显示***促排卵和单精子胞浆注射都能影响h19,mest,peg3和snrpn的mRNA表达水平，而mRNA表达水平的改变主要不是通过甲基化调控，提示ICSI操作确实会导致子代肾脏印记基因表达水平的改变，而引起这种改变的机制还需要进一步研究。

ICSI技术作为辅助受精的一种手段，在近10年获得长足发展。ICSI技术在动物受精机理研究、野生动物遗传资源保存、拯救珍稀动物和胚胎工厂化生产等方面有着非常广阔的应用前景。该技术已经成为人类临床医学上***男性不育症的重要手段，并在全世界得到广泛应用。尽管ICSI已取得很大成就，但是其存在的问题也不容忽视。首先，由于人为地选择，动物自身对精子优胜劣汰的选择遭到破坏。这对动物种群的发展产生的影响还需长期深入的研究。如果能详细了解精子的表型和基因型之间的关系，相信ICSI技术的可靠性会有所明确。其次，作为胚胎生物技术的一部分。ICSI技术也存在总体效率低的问题，而且胚胎移植后妊娠率低而流产率高亦是目前存在的普遍问题。另外，存在出生动物的死亡和畸形等不良后果。因此要更深入地研究其机理和操作等问题，进一步改善ICSI技术。比如Piezo-ICSI技术就可以有效提高成功率。压电式显微操作仪PMM可用于ES细胞注射等实验。

为什么具有“脆性卵膜”的卵子ICSI后容易退化？如下：一、卵子成熟度不足。卵子的成熟包括核成熟（以排出***极体为标志）以及胞质成熟，而胞质成熟往往滞后于核成熟，两者并不完全同步。有对照研究表明，脆性卵膜组的成熟卵细胞比例***低于正常破膜组，ICSI后卵子退化率也高于正常破膜组，这提示了卵子成熟度与卵膜脆性具有一定的相关性，并**终影响了卵子ICSI后是否存活。二、雌***水平。到目前为止，关于雌***水平对脆性卵膜的影响，现有的研究结论并不一致，但归根到底仍然可能是通过影响卵子成熟来改变卵膜的特性。三、ICSI机械操作。一方面ICSI是侵袭性操作，可能破坏卵膜、细胞骨架等细胞器，另一方面是具有脆性卵膜的卵子缺乏“漏斗”的保护作用，细胞骨架和卵膜更容易在ICSI过程中崩解。为避免脆性卵膜卵子ICSI后退化，除了改善注射方式（如进针前利用激光穿透或削薄透明带，操作尽可能轻柔等），还可采用改进的Piezo-ICSI（压电脉冲破膜辅助ICSI），能有效改善注射后卵子退化的情况。此外，在临床促排卵方面，也可考虑调整药物用量，在保证卵泡大小均匀的情况下，尽量推迟扳机时间，提高卵母细胞成熟度，减轻ICSI后卵子退化的比例，以尽可能保证ART***的效果。压电式破膜仪PMM 6可用于核转移实验。美国压电RNA注射

PMM加载于显微操作设备的注射端，兼容性强，安装简便。上海Piezo Micro Manipulator压电辅助孵化

注射—将含一个已制动精子的注射管轻柔刺破透明带和卵膜，进入卵母细胞中心。注入精子时，应尽可能少地带入培养液。之后使用负压破坏卵膜，随后轻柔抽吸细胞质。精子置入、穿过卵膜和抽吸细胞质以***卵母细胞的不同方法对受精和胚胎发育率的影响是一个研究热点。压电辅助的ICSI是一种新型方法，目前已在有ICSI结局不良病史和MⅡ期卵母细胞有限的患者中使用。在ICSI操作过程中，该技术对卵母细胞的损伤较小且可改善受精率和胚胎质量。目前使用压电驱动管的新型ICSI注射技术已成功用于多种哺乳动物。由于该注射器采用超声切割力(而不是刺穿力)穿透卵膜，注射过程中卵母细胞几乎没有变形，因此其对卵母细胞的损伤大幅减少。该技术实现的存活率和成功率同样高。注射后，根据标准实验室方案培养卵母细胞。受精ICSI后，受精率为50%-80%。虽然ICSI不可保证一定受精，但完全受精失败的发生率较低，通常发生于获卵数较低的周期。受精失败的原因通常不是未置入精子或卵母细胞排出精子。其可能是由于卵母细胞***失败，这通常与卵母细胞质量较差或精子无活性有关。上海Piezo Micro Manipulator压电辅助孵化