双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加安全。双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。美国激光荧光双光子显微镜商家
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收只局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，明显降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；进口荧光双光子显微镜磷光寿命计数双光子显微镜大量运营在实验室当中；
实验从理论和实验上评估了多焦点v2PE显微镜的空间分辨率，并与单光子荧光显微镜进行了对比，实验中v2PE的激发波长为521 nm，使用放大倍率为100倍的物镜，尺寸为0.6AU，对直径100nm的荧光颗粒进行了测试性成像，共获得40幅不同采样深度的图像合成为三维图像。图像在横向和纵向的半高全宽分别是177 nm和297 nm，这些值接近显微镜的理论分辨率。后续还利用软件模拟从理论上研究了多焦点v2PE显微技术的空间分辨率，模拟计算显示v2PE点扩散函数(PSF)的横向半高宽与单光子激发荧光(1PE)相似，轴向的半高宽较1PE减少，可以提高空间分辨率。
使用双光子显微镜（2PM）可以以亚细胞分辨率对钙离子传感器和谷氨酸传感器成像，从而测量不透明大脑深处的活动；成像膜电压变化能直接反映神经元活动，但神经元活动的速度对于常规的2PM来说太快。目前电压成像主要通过宽场显微镜实现，但它的空间分辨率较差并且只是于浅层深度。因此要在不透明的大脑中以高空间分辨率对膜电压变化进行成像，需要较提高2PM的成像速率。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器，通过FACED模块可产生80个脉冲焦点，其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像，虚拟源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜，从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm，y轴的横向分辨率为0.35µm。双光子显微镜型号有哪些？
双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜，其原理大致是这样的：首先，让我们来看看什么是荧光显微镜。荧光显微镜是以紫外线为光源，照射被检物体上的荧光物质或是荧光染料，使其发出荧光。相比普通光学显微镜，荧光显微镜运用了波长更短的紫外线，再将可见光过滤掉，提高了分辨力率。而当被检物体过厚时，从不同深度发出的荧光都会打在物镜上，使观察到的像模糊、发虚，无法清楚的知道被检物体的结构。而激光扫描共聚显微镜就是在荧光显微镜的基础上，增加了激光扫描装置，从而解决了上述问题。双光子显微镜知多少。美国ultimainvestigator双光子显微镜作用
双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。美国激光荧光双光子显微镜商家
双光子显微镜的优势：在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。美国激光荧光双光子显微镜商家
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