现在有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）network loading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expression of genetically encoded calcium indicators, GECI）双光子荧光显微镜的发展，使在实验动物处于活动状态下的钙成像技术取得了飞速进展。神经细胞钙成像nVista3.0
神经元钙成像技术离不开钙离子指示剂的应用，不同类型的指示剂各有其独特的功能。那么这些指示剂是如何负载细胞的呢？目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。美国在体钙成像采购信息清醒动物脑功能钙成像的微型显微镜的研究在不断实践中。
通过筛选天然与人工合成的融合体，在小鼠与斑马鱼幼虫身上成功得到以为靶点的致密神经回路报告，报告显示来自神经纤维的伪信号明显减少，信噪比增加，神经元之间的伪影相关性降低。这些结果均说明GCaMP6f和GCaMP7f的细胞体靶向变体（Soma-GCaMP6f，Soma-GCaMP7f）对提高单光子荧光成像技术的精细性起到着重要作用。这种胞体靶向突变体对提高神经信号标记的精细性是否具有组织特异性或物种特异性呢？研究团队针对这一问题，分别在小鼠不同脑区以及斑马鱼幼鱼的整胚转染和斑马鱼不同发育时期的信号采集等方面进行研究。
对于双光子（2P）钙成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个*da的深度限制因素，而对于三光子成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性三光子显微镜比结构性三光子显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布guangfan的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术对钙离子的功能研究中，钙指示剂是必不可少的工具。
大家都知道，只有游离钙才具有生物学活性，而细胞质内钙离子浓度由钙离子的内外流平衡所决定，同时也受钙结合蛋白的影响。细胞外钙离子内流的方式有很多种，其中包括电压门控钙离子通道、离子型谷氨酰胺受体、烟碱型胆碱能受体（nAChR）和瞬时受体电位C型通道（TRPC）等。神经元钙成像的原理就是利用特殊的荧光染料或钙离子指示剂将神经元中钙离子浓度的变化通过荧光强度表现出来，以反映神经元活性。该方法可以同时观察多个功能或位置相关的脑细胞。利用钙离子指示剂检测组织或细胞内钙离子浓度，进而反应组织或细胞内某些活动或反应。神经细胞钙成像nVista3.0
钙离子成像可以追踪神经元动作电位。神经细胞钙成像nVista3.0
多种钙离子指示剂和钙成像手段的存在使研究人员能够根据具体的实验需要进行选择。同样，选择合适的检测设备也是至关重要的。对于使用CCD/sCMOS相机的成像系统来说，有两个要求是很基本的：采集速度：根据不同的应用所需的相机帧速也不同，对于神经细胞来说，一般要求相机速度至少在10fps以上，有些高速应用场景可能需要几百甚至上千Hz的帧速。灵敏度：为了尽可能降低光漂白和其他副作用（特别是蓝光激发时），需要降低激发光强度。因此相机要在较宽的发射光波长范围上具有高灵敏度，才能检测到弱光条件下的信号，并适应不同的染料的光谱发射特性。神经细胞钙成像nVista3.0
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