在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民医学科学院组成跨学科团队，历经三年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申请多项。双光子显微镜角膜成像。美国激光双光子显微镜商家电话
基因编码的荧光探针可用于在突触和细胞分辨率下监测体内神经元信号，这是揭示动物神经活动复杂机制的关键。双光子显微镜(2PM)可以对钙离子传感器和谷氨酸传感器进行亚细胞分辨率的成像，从而测量不透明脑深部的活动。成像膜的电压变化可以直接反映神经元的活动，但神经元活动的速度对于常规的2PM来说太快了。目前，电压成像主要由宽视场显微镜实现，但其空间分辨率较差，且只能在浅深度成像。因此，为了以高空间分辨率成像不透明脑中膜电压的变化，需要将成像速率提高2PM。面向模块输出端的子脉冲序列可视为从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成空间分离和时间延迟的聚焦阵列。然后，该模块被集成到一个带有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是重复频率为1MHz的920nm激光器。FACED模块可以产生80个脉冲焦点，脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像。虚光源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束可以沿Y轴比沿X轴更好地填充物镜，从而在X轴上产生0.82m和0.35m的横向分辨率。进口荧光激光双光子显微镜授权商由于其非侵入性和高分辨率的特点，双光子显微镜成为了研究神经科学、ai症研究、免疫学等领域的重要工具。
相比普通的显微镜电子显微镜可以观察尺度更小的东西，冷冻电镜更是可以观察有活性的生物大分子，而双光子显微镜有什么优势呢？它能做到什么普通光学显微镜做不到的事情吗？原来，双光子显微镜可以精确穿透较厚标本进行定点、***观察！由于电磁波的波长越短，粒子性越强，受散射影响也就越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光，在增加了激光的穿透性的同时还减少了对细胞的毒性。除此之外，因为只有物镜焦点处能发生双光子激发效应，所以扫描的精确度极高，也能提高激发光效率，减少被扫描点之外的荧光物质消耗。
首先，双光子成像采用波长范围约在700~1000 nm的近红外光激发，在组织中的散射系数较小，穿透性很好，因此非常适合厚样本的观察。同时，由于是近红外光激发，也能避免样品中激发波长较短的自发荧光物质的干扰，可获得较强的荧光信号（如下图）。所以双光子成像具有较深的穿透力和较小的光毒性。通常在活物脑组织中双光子显微镜有效成像深度可达200~500 μm，能够较好地进行三维成像。双光子成像的另一大优势在于精确的空间点聚焦性。一般条件下，物质只会被单光子激发，只有在光子密度足够高的情况下，物质才会吸收两个光子从而被激发，所以，双光子只会在光子密度蕞高的物镜焦点附近发生，很少产生焦平面外的杂散光（如下图）。这种性质既提高了成像质量，也降低了样本的光漂白、光损伤区域。基于这些优势，使得双光子显微镜非常适合对活细胞、活组织进行长时间在体成像。双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子。
双光子显微镜是一种先进的成像技术，能够实现细胞或组织的深层观察。它的主要特点是使用双光子激发来产生荧光，从而实现对生物样品的高分辨率成像。双光子显微镜的工作原理是利用激光的脉冲宽度极窄的特性，将高能激光束聚焦到生物样品中，激发出荧光。这个过程需要使用一个特殊的双光子激发源，它能够将一个光子转换为两个光子，其中一个光子用于激发荧光，另一个光子则用于成像。双光子显微镜具有以下优点：高分辨率：由于双光子激发的特性，可以实现对生物样品的高分辨率成像，特别是对于深层组织的观察。穿透深度大：双光子激光的波长较长，能够更好地穿透生物组织，从而实现对深层细胞的观察。荧光寿命长：双光子激发产生的荧光寿命比单光子激发产生的荧光寿命长，这使得双光子显微镜能够更好地区分不同的荧光标记物。减少光毒性：由于双光子激发的能量较低，因此对生物样品的损伤较小，可以减少光毒性。总之，双光子显微镜是一种非常有用的成像技术，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。优势来源于其双光子光源的非线性光学效应。荧光双光子显微镜图像对比度
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双光子的来源:飞秒激光的双光子吸收理论早在1931年就由诺贝尔奖获得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因为激光而得到实验验证，但WinfriedDenk用了近30年才发明了双光子显微镜。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要理解非线性过程。双光子吸收相当于和频产生的非线性过程，需要极高的电场强度，电场取决于聚焦光斑的大小和激光脉冲宽度。聚焦光斑越小，脉冲宽度越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只与物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只有激光脉冲宽度。基于以上分析，能够输出高重复率(100MHz)的超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光已经成为双光子显微镜的标准激发光源。这再次显示了双光子显微镜的优势:双光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光强较低，无法激发，所以双光子成像更清晰。美国激光双光子显微镜商家电话
